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動物細胞工程試題 動物細胞工程題目及答案篇一

【教學目標】 1．知識目標：

1.1簡述動物細胞的培養過程、條件及其應用； 1.2簡述克隆動物的概念含義和基本原理

1.3簡述體細胞核移植技術和動物克隆技術，以及應用前景 1.4簡述細胞融合的方法過程和單克隆抗體的制備過程應用 1.5關注克隆技術的倫理問題。2．能力目標：

2.1通過閱讀、自學、質疑、討論、總結等環節，提高獲取知識、分析問題和解決問題的能力

2.2由植物體細胞雜交技術導出動物細胞融合過程，培養學生的知識遷移能力和思維能力

2.3通過設計單克隆抗體的制備過程，使學生了解生物科學認識模式發展學生的創造性能力。3．情感態度與價值目標：

3.1 初步培養學生探索、創新和合作精神

3.2 明確知識不斷更新并向前發展，認識到學無止境，形成終生學習的意識。

【教學重點】簡述動物細胞的培養過程；舉例說出細胞融合和單克隆抗體；關注克隆技術的倫理問題。

【教學難點】動物細胞培養過程；細胞融合技術和單克隆抗體的制備。【教學設計思路】 采用自學、指導模式對動物細胞培養技術進行較深刻、透徹地學習，這部分內容主要是解決三個問題：（1）為什么要進行動物細胞的培養？（2）什么是動物細胞的培養？（3）怎樣進行動物細胞的培養？第三個問題是本節課的重點。關于動物細胞的培養過程，教師可參照教材中的動物細胞培養過程示意圖進行講解，講解中要注意區分原代培養和傳代培養這兩個概念。對于動物細胞培養的條件，則要從學生已有的內環境的知識出發，啟發學生自己動腦思考這個問題，以加深對培養條件的理解。為學習其他動物細胞工程打好基礎。在動物體細胞核移植技術及克隆動物的教學中，可首先讓學生列舉所知道的克隆動物，調動學生已有的知識。隨后可向學生提問：克隆動物的方法與植物組織培養一樣嗎？然后向學生說明目前動物體細胞克隆是通過核移植技術來實現的，以引入本節的主題。關于核移植技術發展簡史，可讓學生在課堂上閱讀，本節的重點和難點是在動物體細胞核移植技術過程，教材中選用了 “多利羊”為例，來說明體細胞核移植的過程。教師應充分利用和挖掘教材內容，帶領學生一步步弄清動物體細胞核移植技術的過程。對于體細胞核移植技術的應用前景和存在的問題這部分內容，可結合本節教材“積極思維”中的有關問題，讓學生討論。在細胞融合和單克隆抗體的教學中，教師啟發學生回憶植物體細胞雜交過程；通過新舊知識對比，引導學生大膽推測動物細胞融合過程，培養學生知識遷移能力，并通過課件演示細胞融合的全過程，加強教學的直觀性，培養學生的觀察、思維能力。教師要講明動物細胞融合技術的意義和應用，以便自然過渡到單克隆抗體上來。關于單克隆抗體的教學，教師要利用好教材提供的材料，突出從問題入手的思路，先介紹醫療實踐中僅靠細胞培養難以獲得大量抗體，然后，一步一步啟發學生討論怎樣解決這個問題。要把科學家在研制單克隆抗體過程中，通過大膽的想像，創造性地解決問題的過程作為本節教學的重點和亮點，使學生在獲得單克隆抗體知識的同時，受到創新精神的教育。【教學課時】二課時 【教學過程】

（一）導入新課 圖片展示:克隆羊“多利”的復制品 投影：新華網

克隆羊多利重生 這4只克隆羊在遺傳上與多莉毫無差異。多莉誕生于14年前，是第一個使用成熟細胞克隆的哺乳動物。克隆羊多莉(dolly)已經獲得“重生”。最初進行此項克隆研究的英國科學家又培育出4只克隆羊，被形象地稱之為“dollies”(多莉的復數)。它們是多莉的復制品，在遺傳上與多莉絲毫不差，多莉在7年前離開這個世界。

問題導入

師：克隆羊“多利”的重生，采用的是什么技術？ 生：細胞工程技術？

師：動物細胞工程技術到底是干啥的？下面請同學們帶著以下問題閱讀與總結：（閱讀課本p53,回答）

一、動物細胞工程：

1、主要理論依據？ 2技術手段？ 學生：1.細胞生物學 分子生物學

2.①動物細胞和組織培養 ②細胞核移植③體細胞克隆④細胞融合⑤單克隆抗體制備

3.①探索并改造生物的遺傳特性，②大量培養細胞。

師：動物細胞與組織培養是細胞工程的基礎，它開始于20世紀初期，那么動物細胞與組織培養主要是指什么？請讀課本p53-54,完成以下內容。

二、動物細胞與組織培養：

1、概念： ①材料：取自 ； ②場所： 模擬動物體 ；

③條件：在、和 等條件下； ④目的：

使

動

物

細

胞

或

組

織

繼續。

學生：①動物胚胎或出生后不久的幼齡動物的器官或組織

②體外 體內環境 ③無菌 溫度適宜 營養充足 ④生長、增殖并維持原有結構和功能

師：動物細胞與組織培養是指在體外模擬動物體內環境，將動物體細胞或組織，在無菌、溫度適宜和營養充足條件下培養，使其繼續生長、增殖并維持原有結構和功能的技術。那么請同學們思考并討論一下問題：（投影展示）

1、動物細胞培養的原理是什么？

學生：

1、細胞增殖

2、為什么要取動物胚胎或出生后不久的幼齡動物的器官或組織進行培養？

學生：因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強。一般幼體細胞比老齡細胞易培養，分化程度低的細胞比分化程度高的細胞易培養。

3、動物細胞體外培養需要滿足哪些條件？ 學生：①無菌、無毒的環境：（添加一定量的抗生素；定期更換培養液，以便清除代謝產物。）②營養物質(引導學生引導學生引導學生引導學生區分天然培養基與合成培養基區分天然培養基與合成培養基區分天然培養基與合成培養基區分天然培養基與合成培養基)（無機鹽、葡萄糖、氨基酸、核酸、維生素、動物血清等。）③溫度和ph：37℃, 7.2-7.4 ④氣體環境： o2和co2（95%空氣和5% co2）

4、組織分散成單個細胞的方法是什么？ 學生：用胰蛋白酶處理。教師補充：動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。

5、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？ 學生：不能，因為動物細胞培養適宜的ph為7.2—7.4，此環境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。投影展示：動物細胞與組織培養過程

示

意

圖

10代細胞 教師：：：： 懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁生長當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。

思考：細胞發生接觸抑制后如何使細胞繼續分裂增殖？ 學生：將原代培養的細胞分離稀釋后轉入新的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。

思考：傳代培養的細胞能一直傳代下去嗎？

細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數細胞存活到40～50代，這種傳代細胞為細胞株。

細胞系：細胞株傳代至50代后又出現細胞生長停滯狀態，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。教師引導學生總結動物細胞培養過程。

過渡：動物細胞培養能否像植物組織培養那樣最終培養成新個體？我們來一起比較一下這兩個過程：比較項目 植物組織培養 動物細胞培養 因此，目前還不能用類似植物組織培養的方法獲得完整的動物個體，用動物體細胞克隆的動物，實際是通過核移植來實現的。

三、細胞核移植與動物體細胞克隆: 讀課本p54-57,完成以下內容。

1、體細胞克隆： 是將供體 的細胞核與受體去核 的細胞質進行，借助于 的發育能力，經過培養發育成 進而形成 的技術。其關鍵是。

學生：細胞核 卵細胞 人工組合 卵細胞 胚胎 個體 細胞核移植技術

2、細胞核移植： 是一種利用 將某種動物細胞的移入

或

動物的去除細胞核的成熟 內的技術。

學生：：：：顯微操作技術 細胞核 同種 異種

3、展示克隆羊“多利”產生過程歸納克隆流程： 供體細胞 →

①

-------→ ③------→ 早期胚胎------→ 代孕動物 受

體

細

胞

→

②

-------→ 克隆個體

學生：細胞核 去核的卵細胞 融合的細胞

問題：1）、上述多利羊的成功培育過程表明了什么？也反映出了什么問題？

學生：動物體細胞核具有全能性。許多克隆動物表現出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發育困難，臟器缺陷，免疫失調等。

2）、書上說治療性克隆和生殖性克隆的大討論，你有何觀點，請說出來。你認為生殖性克隆會帶來哪些倫理上的問題？（發散思維）3）克隆個體性狀與親本性狀的關系怎樣？ 學生：克隆個體性狀與供核親本性狀一致。

4、意義：在克服動物、創造 等方面有重要意義。

學生：種間雜交繁殖障礙 新物種

5、應用① ；② ； ③ 等。

學生：①利用克隆技術大量復制實驗動物，減少實驗誤差；②利用異種動物借腹妊娠挽救珍稀動物 ；③利用患者自身的細胞培育新的組織和器官以治療疾病。

四、細胞融合與單克隆抗體：讀課本p57,完成以下內容。

（一）細胞融合：

1、概念：指在一定的條件下將 或 細胞 為 的過程。

2、結果：形成，如。

3、原理：

學生：

1、2個 多個 融合 一個細胞

2、雜種細胞 鼠—雞、鼠—猴等

3、細胞膜具有一定的流動性

4、物理法、化學法和生物法

5、制備單克隆抗體 動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較：：：： 植物體細胞雜交（獲得雜種植株）動物細胞融合（制備單抗）原理 融合前的處理 促融方法 意義和用途 過渡：何為單克隆抗體？

（二）單克隆抗體：：：：讀課本p58-59,完成以下內容。

1、概念：用單個b淋巴細胞進行，形成，其就可能產生出化學性質、的抗體——單克隆抗體。學生：無性繁殖細胞群單一性

動物細胞工程試題 動物細胞工程題目及答案篇二

生物化學復習題

第一章: 蛋白質的結構與功能

1．蛋白質元素組成，利用何種元素可推算出其在樣品中含量？ 2．組成蛋白質的氨基酸基本分類，根據是什么？

3．蛋白質的一級結構與空間結構（二、三、四級，基元）概念，穩定力量。4．α－螺旋和β－折疊的結構特征。5．多肽鏈中氨基酸測定，主要分析方法。6．蛋白質分子量測定基本方法有幾種？ 7．蛋白質變性及理化性質改變的特征

8．何謂蛋白質的等電點（pi）？在酸性或堿性環境中，某一pi的蛋白質帶電荷會一樣嗎？會帶何種電荷？ 9．蛋白質親水膠體特征及穩定因素。10．蛋白質分離純化基本依據？常用方法。

第二章: 核酸的結構與功能

1．單核苷酸的組成成分，及其各成分之間的連接方式

atp、nad、andp、fad、camp的組成和中文讀法 2．dna分子一級、二級、三級結構概念

（注意原核與真核生物的相似與區別）

3．參與pr生物合成的三種rna（trna、rrna、mrna）細胞含量、分子大小、穩定性、構成或構型。4．核酸的理化性質包含哪幾個方面？

5．核酸變性、復性、雜交概念（注意在某一種情況下構型的變化）6．dna、rna分離純化的基本原則

7．核酸含量的測定方法有幾種？方法的建立以何種核酸成分為基礎的？

第三章: 酶

1．作為生物催化劑的特點 2．何謂酶的專一性？分幾類？

3．酶分類的根據？分幾類？命名分類？ 4．全酶構成？各成分在酶促反應中作用？ 5．金屬離子在酶分子中作用？

6．b族vit輔酶形式是什么？一般有何作用？ 7．酶的活性中心及必需基團？ 8．酶促反應影響因素有哪些？ 9．最適ph，最適t，km意義。10．酶高效率的機制？

11．何謂酶的抑制作用？抑制劑分類？

12．競爭性抑制劑與非競爭抑制劑對酶的抑制作用方式各是怎樣？

對km，vmax影響如何？

13．從對酶作用考慮，有機磷中毒與重金屬中毒機理及急救機理？ 14．寡聚酶，同工酶，誘導酶。15．酶的活性單位定義。

第四章: 糖代謝 1．糖的化學本質是什么？糖類在體內有何生理功能？ 2．什么是糖酵解？有何生理意義？

3．何謂有氧氧化？有氧氧化主要分為幾個階段？有何生理意義？ 4．何謂三羧酸循環？有何生理作用？ 5．什么是磷酸戊糖途徑？有何生理意義？ 6．什么是糖異生？其生理意義是什么？ 7．試述丙酮酸是如何異生成糖的？ 8．糖原是如何合成和分解的？

9．試比較肝糖原與肌糖原的合成有何異同點？

10．食物中的淀粉是怎樣被消化吸收的？又怎樣轉變成肝糖原？

11．比較糖代謝各途徑在細胞內進行的部位、關鍵酶、產物、atp的生成與消耗情況。

12．下列反應中各需何種輔助因素或輔酶？各起何作用？

（1）丙酮酸→ 乳酸；（2）葡萄糖 → 6一磷酸葡萄糖；（3）糖原（gn）→ 糖原（gn＋l）（4）琥珀酰coa→琥珀酸十 hscoa；（5）丙酮酸十 co2→草酰乙酸；

（6）3-磷酸甘油醛十 pi→ 1，3一二磷酸甘油酸；

（7）1，3-二磷酸甘油酸→ 3-磷酸甘油酸。13．寫出糖酵解和糖異生途徑的關鍵酶

14．6一磷酸葡萄糖、1，6—二磷酸果糖、草酰乙酸是如何徹底氧化的？每 1分子分解時，各產生多少atp？ 15．什么是巴斯德效應？

16．什么是乳酸循環？其生理意義是什么？

17．血糖的來源和去路有那些？胰島素，胰高血糖素，糖皮質激素，腎上腺素如何調節血糖？ 18．什么是糖原累積癥？

第五章: 脂類酸代謝

1.飽和脂酸如何氧化供能？

2.計算軟脂酸氧化成水和co2時，可使多少adp磷酸化生成atp？ 3.在體內糖如何轉變成脂肪？

4.何謂酮體？酮體是如何生成和氧化？酮體代謝有何生理意義？ 5.血漿脂蛋白可分為那幾類？各有何生理功用？

6.何謂脂肪動員？何謂載脂蛋白？何謂脂肪酸的β-氧化？ 7.何謂營養必需脂肪酸？ 8.試述vldl和ldl代謝？

9.列舉下列通路的限速酶及其調節因素。

（1）脂肪酸合成（2）脂肪動員（3）膽固醇含成 10.說明下列通路的生理意義。

（1）甘油一酯支路（2）檸檬酸一丙酮酸循環（3）脂肪酸β-氧化

11.膽汁酸鹽在脂類消化吸收中有何作用？ 12.絲氨酸如何轉變成卵磷脂中膽鹼？

13.計算硬脂酸（c18）徹底氧化時生成的 a t p量及合成一分子硬脂酸需要的a t p、nadph及乙酰coa的量。14.脂肪酸進入肝臟后有哪幾條去路？

15.膽固醇及脂肪酸合成所需原料如何從糖代謝得到供應。16.進食糖類是通過哪些環節而促進脂肪合成的？ 17.比較脂肪酸合成與脂肪酸β-氧化過程的區別。

第六章:生物氧化

1．解釋下列名詞

（1）生物氧化（2）細胞色素（3）呼吸鏈（4）氧化磷酸化（5）p／o值（6）解偶聯劑

3．請寫出nadh氧化及琥珀酸氧化的二條呼吸鏈并比較在組成上的異同點。4．組織中肌酸有何生理功能？

5．動物注射2，4一二硝基苯酚，會立即出現體溫升高，何故？

6．請寫出呼吸鏈抑制劑在呼吸鏈中的作用？為何說氰化物對機體是劇毒物質？ 7．電子傳遞鏈概念及排列組成 8．電子傳遞鏈中atp產生的部位

9．線粒體外還原當量轉運入線粒體內的兩條途徑？

第七章: 氨基酸代謝

1．氮平衡及狀態及意義？營養必需aa 食物pr的互補作用 2．蛋白質的消化、吸收與腐敗 3．體內蛋白質降解途徑

4．聯合脫氨基作用形式及部位特征 5．α－酮酸的去路 6．氨的來源、轉運與去路

7．鳥氨酸循環、部位，過程，調節 8．高血氨癥；肝昏迷氨中毒學說

9．γ－氨基丁酸（ｇａｂａ）、牛磺酸、組胺、５－羥色胺、多胺來源于哪些aa？

10．一碳單位及來源、生理功用

11．巨幼紅細胞貧血與一碳單位和甲硫氨酸循環關聯？ 12．甲硫氨酸循環過程及生理意義 13．何謂活性甲基、活性硫酸？來源？ 14．心肌損傷患者哪種轉氨酶和肌酸激酶升高？

15．tyr與那些神經遞質生成有關？白化癥，黑尿酸癥，巴金森氏與其有何關聯？

第八章: 核苷酸代謝

1．核酸消化吸收的基本過程及其有關的消化酶。

2．核酸在體內分解代謝的基本反應通路，嘌呤與嘧啶的分解產物是什么？ 3．嘌呤和嘧啶的合成原料是什么？ 4．嘌呤嘧啶合成途徑有哪些？特點？ 5．脫氧核糖核酸如何生成？

6．什么是嘌呤和嘧啶核苷酸合成的補救通路？ 7．體內如何調節嘌呤和嘧啶核苷酸的合成？

第九章: 物質代謝調節

1．物質代謝的特點 2．物質代謝的相互聯系 3．組織、器官的代謝特點及聯系（營養物質互變關系）4．代謝調節 細胞水平：

酶的隔離分布意義，選擇幾條相關的代謝途徑說明 代謝調節是通過對關鍵酶活性的調節實現

5．酶活性調節方式：

快速調節：

變構調節及化學修飾調節概念、方式、意義

遲緩調節：

通過對酶蛋白分子的合成或降解改變細胞內酶量。

激素水平的代謝調節：

整體調節：

6．饑餓，應急狀態三大營養物質的代謝狀態如何？

第十章: dna的生物合成

1．遺傳信息傳遞的中心法則，半保留復制 2．簡述原核生物dna-pol的種類及其作用？ 3．dna聚合酶的即時校讀

4．dna復制的保真性所依賴的三種機制。5．復制的半不連續性，崗崎片斷

6．參與原核生物dna復制的各種酶與蛋白質及其作用。

7．何謂突變，突變有哪些類型。（了解影響突變的因素有哪些）8．簡述dna損傷的三種主要修復方式。

9．逆轉錄及逆轉錄酶的三種活性。

第十一章: rna的生物合成

1．轉錄，模板鏈，不對稱轉錄，核心酶（α2ββˊ），斷裂基因 2．何謂啟動子，原核生物啟動子中有哪些特征序列，作用如何？ 3．簡述原核生物轉錄起始過程。4．簡述原核生物轉錄終止的兩種形式。5．簡述真核生物中mrna和trna的轉錄后加工 6．試比較復制和轉錄過程有何相似和不同。

第十二章: 蛋白質的生物合成

1．順反子 遺傳密碼* 開放閱讀框架* s-d序列 2．遺傳密碼有哪些特點？（特點中涉及的概念要掌握）3．氨基酰-trna合成酶的功能及作用特點？ 4．在蛋白質合成過程中，各種rna起什么作用？ 5．簡述蛋白質生物合成的延長過程。6．多聚核蛋白體

7．翻譯后加工包括哪些方面？ 8．分子伴侶

9．以分泌蛋白進入內質網為例，理解蛋白質的靶向輸送。

第十三章: 基因表達調控 1．概念：基因表達、管家基因、組成性表達、操縱子、基因重組、sos反應 2．基因表達的規律 3．基因表達的方式

4．基因轉錄激活調節與哪些基本要素有關？ 5．原核生物轉錄調節的特點 6．何謂乳糖操縱子？其結構組成？

7．在以下狀態時，乳糖操縱子是開啟還是關閉的？為什么？如開啟，其轉錄水平如何？為什么？

a．培養基中同時存在高濃度g和乳糖 b．培養基中只存在乳糖

c．培養基中存在低濃度g和高濃度乳糖

8．trp operon，均為轉錄調節機制，各自的調節機制特點是什么？ 9．真核生物基因組結構特點及表達調控特點。

10．葡萄糖存在時，大腸桿菌不能利用乳糖，當葡萄糖耗盡后，大腸桿菌才利用乳糖。請運用所學乳糖操縱子的有關知識解釋其機制。

第十四章: 基因工程與基因重組

1．自然界常見基因轉移及重組現象有哪些？掌握其定義？ 2．dna克隆技術基本步驟？ 3．常用的工具酶有幾種？ 4．何謂基因載體？有幾類？

5．有哪些方法可以使外源dna和載體dna連接。6．常見的重組體的篩選方式分類？舉例說明。

7．現有一研究項目，擬從人dna中獲得特定的長約1000bp的片段（此片段編碼某生長因子），并擬將此生長因子大量生產。請你根據所學知識（可參閱其它有關資料），擬出一個可行的方案來。8．基本概念：同源重組、特異位點的重組、轉化作用、轉座子、dna克隆、限制性核酸內切酶、粘性末端、鈍性末端、配伍末端、基因組dna文庫、cdna文庫、基因診斷、基因治療

第十五章: 細胞信息轉導

1．細胞信號傳導有關的信息物質分類。2．受體？受體分類（膜受體分類及結構特征）3．受體作用特點 4．傳導途徑：

畫一簡單示意圖，將膜受體介導的信號傳導途徑小結，歸納。

并注意傳導途徑中環節的激活的機制（如g蛋白活化，pka激活，ip3與胞內鈣升高關系等）。

5．掌握camp－pka，ca2+－依賴性蛋白激酶激活途徑。6．受體激酶活性的有關途徑

動物細胞工程試題 動物細胞工程題目及答案篇三

第二節 細胞工程簡介──動物細胞工程

教學目標 1．知識方面

（1）動物細胞培養（知道）。（2）動物細胞融合（知道）。

（3）單克隆抗體的制備及應用（知道）。2．態度觀念方面

（1）初步培養學生勇于探索，不斷創新的精神和合作精神。

（2）通過向學生介紹幾大動物細胞工程技術的發展動態及一些新的研究成果，使學生明確人們對生命奧秘的揭示愈加廣泛和深入，知識不斷更新并向前發展。認識到學無止境，形成終生學習的意識。

3．能力方面

（1）在學習動物細胞培養過程中，學生通過閱讀、自學、質疑、討論、訓練、總結等環節，逐步提高獨立獲取知識的能力、邏輯思維能力、分析問題和解決問題的能力。

（2）由植物體細胞雜交技術導出動物細胞融合過程，培養學生的知識遷移能力、思維能力。

（3）讓學生嘗試設計革克隆抗體的制備過程，指導學生掌握獲取知識和探索生物科學的基本方法，使學生了解生物科學認識模式以發展學生的創造性能力。

重點、難點分析

單克隆抗體既是本小節的重點，也是難點內容。

分析：動物細胞工程常用的技術手段有動物細胞培養、動物細胞融合、單克隆抗體、胚胎移植、核移植等。其中前三大技術為本節教材的主體內容，而胚胎移植、核移植技術以小字科普讀物的形式出現，意在使學生在有所側重的前提下對動物細胞工程發展概況有一個較全面的了解。在教材重點介紹的三大動物細胞工程技術中，動物細胞培養是其他技術（如單克隆抗體、胚胎移植、核移植等）的基礎，其價值更多的是通過其他技術成果來體現的。而動物細胞融合技術目前較為成熟的最重要的用途便是制備單克隆抗體。由此可見，單抗技術應屬較高層次的動物細胞工程技術。對它的學習有助于學生較深刻地領悟動物細胞工程的真諦，并從兩位諾貝爾獎獲得者對單抗獨具匠心的實驗設計中，深刻體會科學態度、科學方法，尤其是創造性的思維品質在科學研究、發明創造中的決定性作用。基于以上認識，單克隆抗體應列為本節的重點內容，同時單克隆抗體技術本身環節多、技術復雜，加之學生對此缺乏必要的感性認識，所以也是本課的難點所在。

教學模式

自學——指導。啟發、探究。教學手段

1．動物細胞培養的自制掛圖。

2．動物細胞融合、單克隆抗體制備過程的教學課件。3．有關克隆羊“多莉”的錄像資料。4．實物投影儀。課時安排 二課時。設計思路

1．采用自學、指導模式對動物細胞培養技術進行較深刻、透徹地學習，為學習其他動物細胞工程技術打好基礎。2．教師啟發學生回憶植物體細胞雜交過程；通過新舊知識對比，引導學生大膽推測動物細胞融合過程，培養學生知識遷移能力，并通過課件演示全過程，加強直觀性，培養學生的觀察、思維能力。

3．教師給出資料，引出探究點。學生通過討論、辯論，設計多種制備革克隆抗體的方案。然后通過觀察全過程課件，質疑、釋疑（多方向），并由學生概括單克隆抗體的制備工程。

4．胚胎移植、核移植為書中小字內容，以學生自學為主，教師予以適當指導、點撥。5．以“多莉”羊的培育過程為主線，將動物細胞工程五種技術的知識有機地串接起來，構成完整的知識體系。

重點提示

1．在教學中，應強化學生的主體意識，開發學生的潛能，使學生的個性在共性發展的同時也能協調發展，使知識不單是講課的內容，考試的內容，而成為有利于學生綜合素質全面提高的載體和素材。教師應善于從教材內容和學生心理狀態出發，采用多種方法設計富有啟發性的問題，創設探索的情境，激發學生思考和探索的欲望，從而達到在獲取知識的同時培養他們的多方面能力的目的。

2．適當增加難度，能在教學過程中引起學生適度的認識沖突。前蘇聯教育家贊可夫就極力主張“高難度原則”，以求得學生在一定困難水平出現認知沖突，增強學生參與討論的積極性，促進其發展。

3．在教學過程中，適度拓寬教學內容，擴大學生的知識面，開發學生的思維空間，有利于學生發散性思維的培養。

4．根據學生的認知水平和教學內容的難易程度，合理安排教學容量，控制好課堂教學的密度；該講的要講深、講透，并善于從多角度、多層面來挖掘知識的蘊含，從而把握好教學的力度；同時還要注意課堂節奏的急緩、疏密、錯落有致。

教學過程

動物細胞工程試題 動物細胞工程題目及答案篇四

細胞工程：現代生物技術的重要組成部分，是在細胞水平研究、開發、利用各類細胞的一門技術。

滅菌：是徹底殺菌，即用物理或化學等方法，殺死物體上的一切微生物以及它們的芽孢或孢子，使物體成為無菌狀態。

消毒：是非徹底殺菌，即用物理或化學等方法，殺死物體上的有害微生物，但不能殺死全部芽孢。

防腐：是抑菌過程，即用化學或物理方法，防止或抑制微生物的生長繁殖。

動物細胞機械分離法：通過適當的物理學處理手段，將動物組織解離成單個細胞的方法。

動物細胞消化分離法：通過酶或螯合劑把已經切成較小體積的組織進一步分散，使之成為小細胞團或單個細胞狀態的方法。

單層細胞培養法：將解離得到的細胞，用培養液制成所需濃度后，接種培養的方法。

懸浮細胞培養法：指細胞懸浮在培養液中生長增殖的培養方法。

動物細胞傳代培養：將原代培養細胞分離、稀釋，并接種到新培養器內，繼續擴大培養的過程。

14、細胞系：原代培養物經首次傳代成功后的細胞群體，由原代培養物中的各種細胞組成。

15、有限細胞系：細胞系不能繼續傳代，或傳代數有限，大多數二倍體細胞為有限細胞系。

16、連續細胞系：細胞系在體外培養時表現出具有無限傳代的潛力，也稱為無限細胞系。

17、細胞株：通過選擇或克隆化培養，從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的細胞群。

27、動物細胞培養用微載體：指直徑在 50 微米到數百微米不等、適合動物細胞貼附和生長的微珠。

1、細胞重組：采用一定方法從活細胞中分離出細胞器及其組分，然后在體外將不同細胞來源的細胞器進行重組，并組裝成有生物活性的細胞或細胞器的一門技術。

2、胞質體：除去細胞核后，由膜包裹的無核細胞。

3、核體：是與細胞質分離得到的細胞核，帶有少量細胞質，并圍有質膜。

4、微細胞：由一條或幾條染色體、少量細胞質和完整質膜包裹而成。

8、核移植技術：利用顯微操作等方法，將一個細胞的核移植到另一個細胞中，或將兩個細胞的細胞核（或細胞質）進行交換。

3、干細胞：來自胚胎、胎兒或成體內，具有無限自我更新和增殖能力以及不同程度分化潛能的一類細胞。

4、胚胎干細胞：由哺乳動物早期胚胎分離克隆出來的未分化細胞，能分化為機體的各種組織細胞，并具有形成嵌合體的能力。

5、誘導性多潛能干細胞：由已分化的體細胞誘導而來，具有類似胚胎干細胞的高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞。（181）

6、全能干細胞：可以發育成一個完整個體的干細胞，一般指哺乳動物的受精卵和 8 個細胞期以前的卵裂球。

7、亞全能干細胞：失去了發育成完整個體的能力，但仍具有形成內、中、外三個胚層來源的所有細胞類型潛能的干細胞。

13、闡述動物細胞工程的應用前景。

（1）生物制品生產

①動物細胞大規模培養技術的建立和發展，大大促進了生物活性物質、藥品和疫苗的生產。

②基因重組技術及雜交廇技術的建立和發展，促進了利用動物細胞表達高質量、高價值蛋白。

③單克隆抗體在多種疾病的診斷和治療中得到廣泛應用。

（2）動物克隆

①采用動物胚胎細胞和體細胞核移植技術，成功克隆多種動物。

②動物克隆技術開發了動物繁殖等領域新途徑。

③治療性克隆也得到廣泛應用。

（3）干細胞技術

①干細胞體外培養將造福人類。

②細胞治療和組織工程。

③藥物篩選。

④成體干細胞可塑性的發現。

13、簡述血清對動物細胞培養的作用。

①豐富的營養物質；②促進細胞生長繁殖；③細胞貼附；④細胞保護；⑤培養基緩沖

30、闡述無血清培養基的主要種類和補充成分。

（1）無血清培養基的主要種類

①一般意義上的無血清培養基

②無動物來源培養基

③無動物蛋白培養基

④化學組分限定培養基

（2）無血清培養基的補充成分。①激素和生長因子

②結合蛋白

③貼壁成分

④微量元素和低分子量營養成分

⑤酶抑制劑

12、簡述動物懸浮細胞培養法的一般步驟。

①分散細胞團塊；②計數細胞；③加入培養液；④接種細胞；⑤培養細胞

23、簡述適合動物細胞培養的生物反應器應具備的條件。

①混合系統設計良好；②反應器內空間利用率高；③能嚴格保證無菌環境；④能精確控制；

⑤便于觀察和采樣

28、簡述動物細胞微載體培養系統的特點。

①細胞產率高；②易于控制；③易于分離、收獲細胞；④反應器改進容易；⑤適合多種貼壁

細胞培養

29、簡述動物細胞微載體培養系統的缺點。

①易受剪切損傷；②價格貴；③需要較高的接種細胞量；④老化后易脫落；⑤需要加入血清

45、闡述微載體動物細胞培養的主要步驟。

①微載體的選擇。主要根據所用細胞種類和培養目的來進行。

②微載體浸泡。使微載體水化膨脹。

③微載體消毒。常用高壓蒸汽滅菌。

④接種。應該使用對數生長期、分散的單細胞。

⑤培養。在培養器內加入培養液、微小球和細胞。

⑥觀察。培養液開始呈酸性時，需要換液，觀察細胞生長情況。

⑦細胞計數。采用消化法后計數。

⑧傳代培養。消化化后進行傳代培養。

⑨分離細胞與收獲。通常采用酶消化法，分離細胞一般采用離心法.46、闡述大規模動物細胞培養技術的應用和存在的問題。

（1）應用。①主要生產有重要價值的產品，已經成為生物醫藥高技術產業的重要部分。

②主要產品有疫苗、干擾素、單克隆抗體、基因重組產品等。

（2）存在的問題

①細胞密度和產物濃度低。

②長時間培養時，細胞分泌產物能力易丟失。

③長時間培養時，產物活性易降低。

④培養成本高。

⑤對細胞代謝和生長特性的基礎研究比較欠缺。

⑥在線監測技術不完善。

3、簡述動物細胞化學誘導融合優勢。

①來源方便；②使用簡便；③不需要特殊儀器設備；④融合效率高

6、簡述動物細胞融合后融合細胞的篩選方法。

①基于酶缺陷型細胞和藥物抗性的雜交篩選；

②基于營養缺陷型細胞所建立的雜交篩選；

③由溫度敏感突變型細胞所建立的雜交篩選；

④應用熒光激活細胞分選儀進雜交細胞篩選

7、簡述單克隆抗體的技術流程。

①親本選擇；②細胞融合；③雜交細胞的篩選；④克隆培養；⑤單克隆抗體生產

8、簡述單克隆抗體制備過程中細胞融合的步驟。

①脾細胞和鼠骨髓瘤細胞的混合；②逐滴加入 peg；③終止 peg 作用；④用 hat 懸浮細胞；

⑤分裝融合細胞

11、簡述影響胞質體制備的因素

①細胞密度；②細胞松弛素劑量；③離心溫度；④離心速度；⑤離心時間

15、簡述核移植的一般操作程序。

①核受體和核供體的制備；②核移植；③重組胚的活化；④培養；⑤胚胎移植

16、簡述核供體細胞對核移植效率的影響因素。

①細胞周期；②細胞類型；③細胞分化程度；④傳代次數；⑤供體動物年齡

23、簡述動物克隆技術中存在的問題。

①成功率低②克隆動物的遺傳問題；③可應用性；④技術不成熟⑤基礎理論研究還很薄弱

24、闡述核移植的一般操作程序。

①核受體細胞的制備。大多采用去核的 mⅱ 期卵母細胞為受體。

②核供體細胞的制備。核供體細胞應該是完整的二倍體、基因組，能正常發育。

③細胞核移植。常用胞質內注射和透明帶下注射兩種方法。

④重組胚的活化。一般重組胚電融合時所施加的電脈沖在誘導融合時，具有激活重組胚的作用。

⑤重組胚的培養。有體內和體外培養兩種方式。

⑥重組胚的胚胎移植。胚胎移植后的妊娠率和產仔率是判斷移植效率的最終標準。

⑦核移植后代的鑒定。一般從形態、性別上鑒定，還可采用分子生物學技術鑒定。

25、闡述動物克隆技術的意義及存在的問題。

（1）動克隆技術的意義

①促進生物學基礎問題的研究 ②加速良種繁育，保護瀕危動物 ③培育轉基因克隆動物，生產生物藥物 ④與基因和干細胞技術結合，開展治療性克隆

（2）動物克隆技術中存在的問題

①成功率低②克隆動物的遺傳問題③可應用性④技術不成熟⑤基礎理論研究還很薄弱

18、簡述胚胎干細胞的形態學特征。

①細胞體積小；②核大；③核質比例高；④核仁明顯；⑤體外培養呈集落狀生長

19、簡述用于胚胎干細胞鑒定的分子特征。

①堿性磷酸酶（akp）；②轉錄因子 oct-4；③端粒酶；④階段性特異性胚胎細胞表面抗原（ssea）

20、簡述動物細胞分離純化的常用技術。

①利用細胞體積；②利用細胞密度；③選擇性細胞凝集；④基于不同黏附特性；⑤利用細胞

表面標志

簡述誘導多潛能干細胞（ips）的應用前景。

①細胞核重編程機制的研究；②臨床醫學研究；③新藥研發及篩選；④其他物種 ips 細胞的建立

28、闡述干細胞的概念、干細胞的分類和生物學特點。

（1）干細胞是指來自胚胎、胎兒或成體內，具有無限自我更新和增殖能力以及不同程度分

化潛能的一類細胞。

（2）干細胞的分類

①根據來源分為胚胎干細胞、成體干細胞和誘導性多潛能干細胞。

②根據分化潛能分為全能干細胞、亞全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞

（3）干細胞的生物學特點有：

①自我更新能力。指分裂后子代干細胞能保持與自己相同的基因型與表型，維持未分化狀

態并具有相同的分化潛能。

②分化能力。指分裂后轉變為形態、機能、化學構成上與自己相異的子代細胞。

③增殖能力。指通過細胞有絲分裂實現細胞數量的擴增。

29、闡述胚胎干細胞的應用前景和存在問題。

胚胎干細胞：由哺乳動物早期胚胎分離克隆出來的未分化細胞，能分化為機體的各種組織細

胞，并具有形成嵌合體的能力。

（1）胚胎干細胞的應用前景

①探討胚胎發育的調控機制。②臨床應用。可用于臨床細胞、組織和器官的修復和移植治療，建立動物模型等。③建立藥物篩選和研究平臺 ④動物克隆及改良

（2）存在的問題

①維持胚胎干細胞未分化狀態的機制及定向誘導分化的調控機制尚不清楚。②臨床治療存在安全性問題 ③器官克隆與移植仍有待于技術上的突破。④面臨倫理、宗教和社會學問題

30、闡述什么是組織工程及理想種子細胞的標準。

組織工程：是將細胞工程和材料科學相結合，利用具有較好生物相容性的材料，按缺損組織

或器官的結構要求制成模型或支架放在體外培養系統中，使細胞沿著模型或支架不斷生長擴

增，構建成新的組織、器官。

理想種子細胞的標準主要包括：

①來源廣，數量充足 ②容易培養，黏附力大，增殖力強，可大量擴增 ③遺傳背景穩定，具備特定的生物學功能 ④純度高，具有特定功能的細胞占主導 ⑤免疫排斥反應極小或無免疫排斥反應 ⑥分子結構和功能與再生組織的正常細胞相似⑦臨床上易取得，供體損傷小，具有實用性 ⑧植入體內能高質量地修復組織并能保持良好的遠期效果

動物細胞工程試題 動物細胞工程題目及答案篇五

1.體外培養的細胞按生長方式可分為哪二種? 按細胞在體外生長的形態特征,可分為哪幾種常見類型? ⑴按生長方式分為二型：

粘附型細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。

懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態下即可生長的細胞。（絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞。）

⑵可分四型：(1)上皮型細胞(2)成纖維型細胞(3)游走型細胞(4)多形型細胞 2.簡述體外培養細胞的整個生命活動過程的分期及每代貼附生長細胞的生長過程 ⑴通常，體外培養細胞的全部生命期大致可被分為以下三個階段：

①原代培養期：也稱初代培養，是指從機體中取出細胞接種培養到第一次傳代之前的這一階段。此期的細胞呈現出活躍移動的特點，可見細胞分裂，但不旺盛。處于原代培養階段的細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上有很大的相似性。細胞群具有明顯的異質性，細胞間的相互依存性強，在軟瓊脂培養基培養時細胞集落形成率很低。②．傳代期 ：通常是培養細胞全生命期中持續時間最長的時期，原代培養的細胞經傳代后常被稱做細胞系。一般情況下，正常體細胞在傳代10-50次左右后，細胞分裂的能力就會逐漸減弱，甚至完全喪失，細胞便進入衰退期。

③衰退期：處于衰退期的培養細胞，增殖速率已經變得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。

以上特點，主要是針對體外培養的機體正常細胞，對于體外發生轉化的細胞和腫瘤細胞而言，永生性或惡型性的獲得使得這類細胞獲得持久性的增殖能力，這樣的細胞群體常被稱為無限細胞系或連續細胞系。

⑵每代貼附生長細胞的生長過程：①游離期：細胞接種后在培養液中呈懸浮狀態，也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。時間：10分鐘一4小時②貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。底物：玻璃、塑料、膠原、其它細胞等③潛伏期：此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。④對數生長期：細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。⑤停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂 機制：接觸抑制、密度限制 3.簡述體外培養細胞對生存環境的基本要求.⑴細胞的營養需要：①基本營養物質： 氨基酸（１２種＋谷氨酰胺）、維生素、葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無機離子。②促細胞生長因子：多由血清提供

⑵細胞的生存環境：①溫度條件對細胞生長的影響：不同生物來源的組織細胞培養溫度不同；體外培養動物細胞最常用的溫度是37℃，耐低溫不耐高溫。在生理溫度范圍內，溫度與細胞生長率之間存在正相關關系。②氣相環境對細胞生長的影響：動物細胞培養的氣相環境都是采用5%co2與95%空氣（提供氧）的混合氣體。ｏ2參與細胞的能量代謝過程，ｃｏ2用于維持培養液的酸堿度，一般多為開放式培養 ③培養液的酸堿度對細胞生長的影響：大多數的有機體細胞能在ph6.0～8.0的環境中生存。最適宜的ph值范圍是7.2～7.4。體外培養的正常細胞耐酸能力要強于耐堿能力④無污染、無毒。

4．什么是細胞培養用液,主要分為哪幾類? ⑴培養用液是維護組織細胞生存、生長及進行細胞培養各項操作過程中所需的基本溶液。⑵主要包括：平衡鹽溶液 ；

培養基；

其他培養用液。5．d-hank’s與hank’s的主要區別是什么? d-hank’s不含有ca2+、mg2+，常用于配制胰酶溶液。6．簡述胰酶的常用濃度及配制時的注意事項。

胰酶(trypsin)溶液： 濃度一般為0.1％～0.25％，配制時要用不含ca2+、mg2+及血清的平衡鹽溶液。

7.細胞培養中血清的主要作用？

(1)提供基本營養物質 ；(2)提供貼壁和擴展因子(3)提供激素及各種生長因子；(4)提供結合蛋白(5)對培養中的細胞提供某些保護作用 8.血清的使用與儲存有哪些注意事項？

（1）使用前的處理：使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新生牛血清可以考慮不經滅活直接用于細胞培養。

（2）儲存條件：血清一般儲存于－20℃,同時應避免反復凍融。大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如10ml、20ml、50ml，儲存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。9.簡述干粉培養基的配制過程。

dmem培養液的配制（舉例）： ⑴900 ml ddh2o于1000 ml燒杯中，將dmem粉1包倒入其中，盛粉袋用50 ml ddh2o分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。⑵用5％－10％的nahco3調ph至7.2。⑶加青、鏈霉素至終濃度100u/ml 和100ug/ml ⑷用0.22um的濾膜過濾除菌。⑸分裝（200 ml左右）后4℃冰箱保存。

10.細胞培養工作室可分為那幾個部分，各有什么作用? 一般包括：準備室、培養室和緩沖室。作用：⑴準備室：用于進行培養器皿的清洗、包裝、培養物質的準備和消毒以及供應物品的保藏等。⑵培養室：用于進行細胞培養和各種無菌操作的實驗室。其基本條件是：清潔、無菌、干燥、不通風，并具有適宜的光線。天花板不宜高過2.5m。⑶緩沖室：（更衣室）2培養箱的作用及使用中的注意事項。

用于維持適當溫度、濕度與ph。注意事項：⑴質量關鍵在控溫裝置，溫度變化一般不應超過0.5度;培養箱的溫度設在35～37℃，這是人和哺乳動物培養細胞的最適溫度。⑵培養容器需與外界保持通氣狀態。⑶箱內空氣應保持干凈，定期消毒（紫外燈、酒精）⑷水槽:保持一定濕度

12.試述清潔液的配方組成及配制時的注意事項。

⑴清潔液 :重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml），強清潔液

63∶1000∶200，次強清洗液

120∶ 200∶1000，弱清潔液

100∶ 100∶1000 ⑵配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸，并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色 13．簡述消毒滅菌的常用方法、要求條件及主要應用范圍。⑴物理消毒滅菌法

①紫外線：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒的培養器皿。消毒時間：30min（至少）； 紫外殺菌功能除了紫外本身以外，還可以由產生的臭氧來完成。紫外滅菌以后，最好過一個小時再進去。②過濾：0.22μm（適用于液體）③濕熱（高壓蒸氣滅菌法）15磅,121℃，20min 各種物品有效消毒壓力和時間不同，一般要求如下：

培養用液、橡膠制品

l0磅l0分鐘

布類、玻璃制品、金屬器械等

15磅20分鐘

④干烤：160℃, 2 小時（適用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打開箱門，以防冷空氣驟然進入引起玻璃炸裂，影響消毒效果。

⑵化學消毒滅菌法：①7５%酒精

主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內的壁面處理。②1－２‰新潔爾滅

主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。③抗生素

主要用于培養用液滅菌或預防培養物污染。細胞培養中最常用的抗生素是青霉素（常用濃度是100u/ml）與鏈霉素（100μg/ml）。不要在原代培養中加入抗生素。

14.如何對玻璃器皿進行有效清洗？

玻璃器皿的清洗：浸泡—刷洗(+烘干)—浸酸—沖洗；清洗后的玻璃器皿：干凈透明無油跡。⑴浸泡： ①初次使用和培養使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉。②新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等。先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質。③再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的殘留蛋白質，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。⑵刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。自然晾干或烘干后泡酸。⑶浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液（洗液）中。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間：一般為過夜，不應少于6 小時。⑷沖洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗,使之盡量不留污染或清潔液的殘 跡。最好用洗滌裝置。如用手工操作，需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，然后用蒸餾水清洗3-5 次，晾干（或烘干）備用 15．細胞培養中最常用的抗生素及使用濃度是什么? 青霉素（常用濃度是100u/ml）與鏈霉素（100μg/ml）。

16．什么是原代培養？簡述原代培養方法的分類及主要操作步驟。

⑴原代培養：取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱原代培養。⑵原代培養方法分類：貼塊法和消化法。消化法又分為冷消化與熱消化；一次性消化與分次消化。主要步驟：

貼塊法：將取得洗凈并剔去多余成分的組織切成約1mm3大小的植塊，用于植塊培養。消化法：將取得洗凈并剔去多余成分的組織剪碎——蛋白酶溶液消化——機械方吹打組織塊—對濾過液離心（<1000r/min, <10min）——用培養液懸浮成細胞懸液——計數并調節細胞密度——用于分離細胞培養

17．何謂傳代培養？簡述貼壁細胞的傳代操作步驟。

⑴傳代培養是指細胞從一個培養瓶以1：2或其他比率轉移，接種到另一培養瓶的培養。⑵貼壁細胞傳代培養： ①選取生長良好的細胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養液，加入2～3ml的d-hanks液，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片。②加入適量0.１％－ 0.25％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突起出現空隙時，倒去酶液。③用hanks液洗滌1次，加入適量培養液，反復吹打細胞，使其成細胞懸液。④以1：2或1：3進行分裝，并在培養瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37 ℃co2培養箱培養。⑤觀察：細胞培養24h后，即可觀察培養液的顏色及細胞的生長情況。18．收集細胞時一般常用的轉速和時間是多少？ 轉速：1000r/min；時間：5min

19.什么是冷凍保存？影響細胞冷凍保存效果的因素有哪些？

⑴冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養物懸浮在加有冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件)，并在此溫度下對其長期保存的過程。⑵①冷凍速率當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結冰，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高，產生溶質損傷。

當冷凍速度過快時，細胞內水分來不及外滲，會形成較大冰晶,造成細胞膜及細胞器的破壞，產生細胞內冰晶損傷。②冷凍保存溫度：液氮溫度(-196℃)是目前最佳冷凍保存溫度。應用-70℃～-80℃條件冷凍保存細胞，短期內對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯下降。③復溫速率 指在細胞復蘇時溫度升高的速度。一般來說復溫速度越快越好。常規的做法是，在37℃水浴中，于1～2min內完成復溫。在冷凍復蘇中遵循：慢凍速溶原則。④冷凍保護劑：是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質。

分為：滲透性：

常用甘油、dmso

非滲透性

甘油或二甲基亞砜這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。

保護機制：是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷；同時，細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和dmso并不能防止細胞內結冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷，讓甘油或dmso等充分滲到細胞內，在細胞內外達到平衡以起到充分的保護作用。目前，dmso的應用比甘油更為廣泛。

非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質。20．凍存的細胞一般如何復蘇？

1)將恒溫水浴箱的溫度調至37～40℃。2)從液氮中取出凍存小管，立即投入37～40℃溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。要在1～2min內完成復溫。3)將細胞凍存懸液移入離心管，加入約5m1培養液，輕輕吹勻。4)將細胞懸液經800～1000 r/min離心5min。棄上清液。5)給細胞沉淀物加入完全培養液，輕輕吹吸均勻。將細胞懸液移入培養瓶內，加足培養液進行培養。21．簡述培養細胞的非玻璃化凍存過程。

非玻璃化凍存——是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-70～-80℃，然后投入液氮進行保存；該種方法凍結的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。

凍存過程：(1)待凍存細胞懸液的準備 ：①按常規方法消化處于對數生長期的細胞培養物,制備成單細胞懸液,計算細胞總數。②將細胞懸液以800～1000r／min離心5min，棄上清液。③向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細胞密度達1×106～1×107個/ml。④按每管1～1.5ml的量，分裝于凍存小管內。擰緊管蓋。⑤在凍存小管上做標記，包括細胞代號及凍存日期。

(2)分級冷凍：①先將凍存小管放人普通冰箱冷藏層(4～8℃)，約40min。②接著置于普通冰箱冷凍層(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下過夜。⑤最后將凍存小管投入液氮保存。還有一種簡單的方法，就是將凍存小管先懸掛在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。第三種方法是，用4℃預冷的冷凍保護液懸浮細胞，分裝凍存小管后，將凍存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒內封好，立刻將小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。

(3)記錄：做好凍存記錄。記錄內容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及凍存經手人。22．dmso使用時應注意哪些事項？

⑴在使用dmso前，不需要對其進行高壓滅菌，因其本身有滅菌作用。⑵在常溫下，dmso對人體有毒，故在配制冷凍保護劑時最好帶手套。

⑶由于許多冷凍保護劑(如dmso))在低溫條件下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫融解后要及時洗除冷凍保護劑。23.細胞培養中常見有哪些微生物污染，有何主要特征？

⑴真菌污染：真菌種類多，形態各異，但污染后均不難發現，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下觀察呈絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌呈卵圓形態，散在于細胞周邊和細胞之間生長。⑵細菌污染：污染后大多能改變培養液ph培養液變混濁，毒性大的細菌很快導致細胞崩解死亡。加用抗生素的培養用液一般可預防和排除個別少量細菌的污染。⑶支原體污染：支原體是細胞培養中最常見、不易被察覺和干擾實驗結果的一種污染。24．運送細胞的比較簡便的方法是哪一種，簡述其過程。

⑴一是用液氮或干冰保存運輸，效果較好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸發均較快，適于空運，比較麻煩;二是充液法運輸，比較簡便。

⑵充液法運輸操作如下： ①選生長狀態良好的細胞，待達80%或90%匯合時，去掉舊培養液換入新培養液，量要達到培養瓶的頸部(過滿易污染)，保留少許空間，塞緊瓶塞，空氣過多運輸中氣泡運動易使細胞脫落;②妥善包裝和運送；一般在不超過四五天到達目的地的情況下，對細胞活力無嚴重影響;③到達后，倒出大部分培養液，保留正常量，置37℃培養，次日傳代。25.簡述細胞污染的概念及種類.⑴細胞污染: 凡混入培養環境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物，都視為污染。⑵組織培養污染: 微生物：真菌、細菌、支原體和病毒；化學物質：影響細胞生存的非細胞所需的化學成分；細胞：不同細胞類型的交叉污染。

26.細胞培養中污染主要通過哪些途徑，一般如何預防？

⑴空氣: 培養設施不宜置于通風場所；定期清理凈化工作臺的過濾層，防止阻塞；操作中應減少空氣流動；帶口罩；夏季潮濕季節空氣中含菌數量多，每立方米內含菌數不應超過1～5個。⑵清洗消毒：培養器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養用液滅菌不徹底等，都可引入有害物。⑶操作：實驗操作馬虎、動作不準確、消毒觀念不強，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口時不嚴，都可發生污染。同時培養兩種以上細胞，操作不慎使用同一吸管或培養用液，可能導致細胞交叉污染。⑷血清：血清也是污染細胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測不嚴，常已被支原體和病毒污染。⑸組織：初代培養組織常有污染；有的是在手術中污染，有的本身可能是被污染的組織(如已發生潰爛的腫瘤組織)；手術用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染。

27． 細胞計數的操作要領及計算公式是什么？

⑴具體操作程序如下：①取血細胞計數板和蓋玻片，用75%酒精擦凈。將蓋玻片放于計數板上。②用滴管取混合均勻的細胞懸液，滴入計數室內。要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。滴加細胞懸液后約靜置1分鐘后則可以進行計數。③統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，分別數出四角的四個大格（每個大格含有16個中格）中的細胞數。對壓邊線細胞：計上不計下，計左不計右

⑵計算：一般以每毫升含細胞數來表示，大方格的面積為1mm2，室深為0.1mm，則體積為0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才為1ml體積。所以計算公式為：細胞懸液的細胞數）/ml ＝（四個大格子細胞數/4)×104 ×稀釋倍數；計數中，如果細胞懸液的細胞濃度過高，必須稀釋后再計；如果細胞數太少,可離心濃縮后再計。每個細胞懸液至少滴樣兩次求平均值。

⑶用細胞計數板計數時應注意的事項:①不要漏計，不要重復②細胞懸液應混合均勻③濃度不可過高也不可過低。

28.簡述細胞生長曲線繪制過程及其應用。

⑴細胞生長曲線(cell growth curve)是觀測細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標，可根據細胞生長曲線分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。

⑵制作方法：①培養細胞：首先在2４孔培養板內分別接種相同數量的細胞。計數并記錄接種的細胞懸液之密度。②計數細胞密度：從接種時間算起，每隔24h計數３孔內的細胞密度，算出平均值。為提高準確率，對每孔細胞可計數2～3次。如此操作至第七天結束。③繪制曲線：以培養時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標，將全部結果在坐標紙上繪圖，即得所培養細胞的生長曲線。29.簡述mtt比色法的原理及操作過程。

⑴原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將染料mtt(二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽)轉變為不可溶性的紫色結晶，后者被dmso（或酸性異丙醇）溶解后所呈現的色度(用od值表示)反映出活細胞的代謝水平。死亡細胞則無此酶活性。溶液的配制

用pbs液(ph7.2)或者生理鹽水將mtt配成5mg／m1的溶液。（用0.2μm濾膜過濾）。保存：于4℃避光保存。可用2周。若暫不用，可凍存。

2.實驗過程：（1）、將細胞培養于96孔培養板。（2）、按不同實驗要求處理細胞。（3）、每孔加入15-20μlmtt液，繼續培養3～4h。（4）吸去培養液，每孔加入200μldmso,在微型振蕩器振蕩5min,充分溶解混勻。（5）在酶標儀上測定光吸收。測定波長為490nm，以只加培養液的的培養皿為空白對照。

3.結果分析 ：細胞存活率=實驗組光吸收值/對照組光吸收值*100％

4.注意事項：(1)高濃度血清可影響光吸收值,常使用含10%血清的培養液,在加入異丙醇溶液或dmso前盡量吸凈培養液。(2)吸去培養液時動作要慢,以免吸去形成的結晶。30.簡述臺盼藍排除檢測法原理

原理：由于死細胞的細胞膜通透性發生改變，某些染料可大量進入卻不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應而區分開兩種細胞。最常用的為“臺盼藍排除檢測法”

(2)活體染色與細胞計數：①將1滴細胞懸液(貼壁細胞可經0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細胞懸液)與2滴臺盼藍液混合后，滴入細胞計數板。②2min后，在顯微鏡下計數至少200個細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。計算活細胞百分比。

注意事項:臺盼藍染細胞時，時間不宜過長。否則，部分活細胞也會著色，會干擾實驗結果。