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【答案】D

【解析】

試題分析：將微生物的接種工具，如接種環、接種針或其他的金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速徹底地滅菌，A正確；接種環必須冷卻后，才可以伸入菌液中蘸取一環液，否則會燒傷或燒死微生物，B正確；蘸取菌液和劃線要在火焰旁進行，防止空氣中的雜菌，C正確；劃線時要避免最后一區的劃線與第一區線連． 因為最后一區是細菌最稀少的，而第一區是細菌最致密的，如果連在一起則有可能影響單個菌落的分離效果，D錯誤。